Resumen
Antecedentes: Dada su importancia para
evaluar la digestibilidad de los alimentos para rumiantes, el artículo se
propuso brindar información sobre algunos aspectos generales del desarrollo de
la técnica de producción de gas in vitro
y referirse a los usos que hoy día se dan a la misma. Desarrollo: Los
orígenes de la técnica se remontan a los trabajos en 1979. Desde entonces ha
habido cambios en su forma de aplicarla manteniendo la esencia de medir la
producción de gas que se produce cuando se inocula la muestra con líquido
ruminal, heces o enzimas en un medio mineral amortiguado por bicarbonatos que
libera una cantidad de gas proporcional a los ácidos grasos volátiles
producidos. La forma en que se mide la cantidad de gas ha cambiado hasta llegar
a la utilización de transductores que se acoplan a computadoras. La técnica ha
sido usada para múltiples estudios que se reseñan en el artículo, a la par que
la referencia a algunos trabajos dedicados a su perfeccionamiento a partir de
dificultades que se presentaron. Conclusiones: Se concluye que la
técnica in vitro de producción de
gases es probablemente la herramienta más versátil de medición de la
digestibilidad; presenta procedimientos didácticos y accesibles; acarrea menos
costos; además representa una alternativa más compatible para las legislaciones
de bienestar animal, al usar las heces como inóculo, y que queda aún por hacer
para lograr una mejor precisión y exactitud y la posible aplicación en otros
campos de evaluación de los alimentos para animales.
Palabras clave: digestibilidad, ética animal, evaluación de
alimentos, heces depuestas (Fuente: AIMS)
Abstract
Introduction: Given its importance in evaluating the digestibility of ruminant foods for ruminants, the paper aimed to bring information on some general aspects of the in vitro gas production technique and refers to the uses that are given to it. Development: The origins of the technique date back to the work in 1979. Since then there have been changes in the way it is applied, maintaining the essence of measuring the gas production that occurs when the sample is inoculated with rumen fluid, feces or enzymes in a buffered mineral medium based on bicarbonates that releases an amount of gas proportional to the volatile fatty acids produced. The way in which the amount of gas is measured has changed till the now mainly used transducers that are coupled to computers. The technique has been used for multiple studies that were reviewed, as well as some works dedicated to its improvement based on difficulties that arose. Conclusions: It is concluded that the in vitro gas production technique is probably the most versatile tool for measuring digestibility; it presents didactic and accessible procedures; entails fewer costs and also represents a more compatible alternative for animal welfare legislation, by using voided feces as inoculum and that still needs more to be done in order to achieve better precision and accuracy, and the possible application in other fields of animal food evaluation.
Key words: digestibility, animal ethics, food evaluation,
voided feces (Source: AIMS)
INTRODUCCIÓN
El mejor reflejo del valor nutritivo de un alimento
es la respuesta productiva de los animales que lo utilizan. Tradicionalmente se
afirma que depende, fundamentalmente, de factores tales como su consumo,
composición química y la digestibilidad (Baumont et
al., 2000).
La evaluación de los alimentos debe definir las características
que permiten predecir el comportamiento productivo del animal como la ganancia
de peso, la producción de leche, el crecimiento de la lana, etc. En tal
sentido, las técnicas con cada vez mayor presencia del trabajo de laboratorio y
menor uso de animales han venido ganando terreno debido a su rapidez y
relativamente bajo costo (Posada y Noguera, 2005). Usualmente, se usa el
término digestibilidad para representar la cantidad de materias secas y/o
nutrientes que son absorbidos en el tracto gastrointestinal del total consumido
por el animal,
Tanto como la degradabilidad ruminal o in sacco, las técnicas de digestibilidad in vitro y más específicamente la de
producción de gas han ido cobrando cada vez mayor importancia (Ayasan et al.,
2018). El presente trabajo pretende recopilar información sobre algunos
aspectos generales de la técnica y referirse al alcance que hasta hoy día ha
tenido la misma.
DESARROLLO
Breve bosquejo y desarrollo histórico
La técnica llamada de gas in vitro (GIV) desarrollada por Menke et al.
(1979) quedó para la historia como método estándar al ser adoptado por el
sistema alemán de evaluación de alimentos. Los recipientes de incubación,
jeringuillas o botellas, se colocan en un baño de agua regulado a 39±0.5 °C. La producción de gas que se produce cuando se
inocula la muestra con líquido ruminal, heces o enzimas en un medio mineral
amortiguado por bicarbonatos que libera una cantidad de gas proporcional a los
ácidos grasos volátiles producidos. Para forrajes, el tiempo de lectura
generalmente utilizado es después de 3, 6, 12, 24, 48, 72 y 96 horas, pero para
concentrados es necesario leer más frecuentemente en las primeras 24 horas. Las
lecturas en intervalos de una hora elevan notablemente la precisión, lo que
permite obtener también una descripción más exacta de la fase lag (Mauricio et al., 2001; Sobalvarro et
al., 2020; Juraci et al., 2023).
Por otro lado, en época tan temprana como
1974, se había descrito un criterio diferente para la medición de la producción
de gas in vitro (Wilkins, 1974) que consistía en mantener la
fermentación en un recipiente sellado y medir la presión en el espacio “vacío”.
El principio de medir la presión con sensor apropiado ha sido ampliamente
adoptado con diferentes variantes. La más simple fue descrita por Theodorou et al.,
(1994) y consiste en medir manualmente la presión con el uso de un transductor.
Estos autores propusieron
un sistema semiautomático en el cual los sustratos se incuban en frascos
sellados donde los gases de la fermentación se acumulan en el espacio superior
y se usa una combinación de jeringa/transductor de presión para medir y liberar
el gas acumulado hasta restaurar la presión atmosférica en el interior del
frasco. Se usan las mediciones de presión del gas acumulado en el espacio
superior para generar estimados del volumen de gas.
A diferencia
de los sistemas completamente automáticos, que combinan cada botella con su
propio transductor de presión, este utiliza un único transductor que
manualmente se traslada a todos los frascos de fermentación. Las principales
ventajas del sistema son su elevada capacidad, bajo costo y su fácil mantenimiento.
Métodos con el uso de transductores, más o menos
automatizados han sido descrito por varios autores (Van Gelder
et al., 2005; Van Laar et al., 2006; Rodríguez et al., 2017).
La mayor innovación de la técnica de GIV
es que se mide la producción de gas de la muestra en lugar de su degradación (Posada
y Noguera, 2005); el mismo postulado continúa hasta hoy, aun cuando el método
ha sido simplificado, mejorado y automatizado con el auxilio de las
computadoras (García et al., 2022)
Heces
como inoculo
En la búsqueda por encontrar inóculos
alternativos al líquido ruminal las heces han ocupado un lugar preponderante
(Bauer et al., 2004; Youssef
y Kamphues, 2018).
En fecha temprana Jones y Barnes (1996) llevaron
a cabo estudios de digestibilidad de la materia seca in vitro de
leguminosas tropicales con fluido ruminal y heces bovinas como fuente de
inóculo. Los valores de digestibilidad obtenidos con el uso de fluido fecal
fueron linealmente correlacionados con aquellos obtenidos con fluido ruminal
(r=0.98).
En trabajos comparativos entre heces de
vacas y líquido ruminal, Akhter et al. (1999)
concluyen que las primeras pueden ser una alternativa a los segundos en la
evaluación de la digestibilidad in vitro de forrajes. Resultados
similares fueron publicados por Martínez et al. (2008); Sáenz et al. (2022).
Las heces de vaca y ovejas han sido
utilizadas como inóculo alternativo y su potencial en las técnicas de gas in vitro establecido (Varadyová et al.,
2005; Martinez et
al., 2005; Posada et al., 2012; Pandian et al.,
2016; Sáenz et al., 2022).
El empeño ha estado motivado más que otra
cosa por cuestiones bioéticas como los animales quirúrgicamente modificados.
La influencia del inóculo
Entre los factores muy a tener en cuenta
en la producción de GIV ya sea con líquido ruminal (LR) o heces es determinante
controlar la variabilidad que muestra el inoculo (Martínez et al., 2005).
En tal sentido, son prácticas comunes,
mezclar inóculos provenientes de diferentes animales e introducir muestras de
referencia para corregir las diferencias debidas a la influencia del inóculo
(Mauricio et al., 2001; Posada y
Noguera, 2005; Martínez et al.,
2010).
Los criterios generalmente aplicados son
que al igual que los blancos (jeringas o transductores sin muestra), los
estándares o muestras de referencia deben ser corridos en cada experimento.
Cada muestra de referencia ha de tener un perfil de gas conocido, determinado
por promedio de muchas réplicas. Si la muestra de referencia incluida dentro de
una corrida produce entre el 90 y el 110% del gas con respecto al valor
promedio, entonces el fluido ruminal es calificado como "normal" y
todas las medidas de volumen de gas son corregidas por el factor "promedio
del volumen de la muestra de referencia/volumen de la muestra en la
corrida". Si, por el contrario, el volumen de la muestra de referencia en
la corrida está situado por fuera de este rango, el inóculo se clasifica como
"alterado" y los datos de la corrida se suelen desechar (Schofield,
2000).
La preparación de muestras de referencia
lo suficientemente estables y homogéneas es una necesidad. El uso de estándar
interno tiene como importante limitante que la muestra que se use como
referencia debe tener un perfil similar a la que se analiza, en aras de que se
puedan extrapolar los resultados. Por otro lado, ha de cuidarse de preparar
siempre nuevas muestras cuando aún hay suficiente cantidad de las que se
pretendan reemplazar para logar un vínculo confiable entre ambas. La
calibración externa dependerá de contar con un buen número de muestras cuya
digestibilidad in vivo o in sacco haya
sido bien determinada (Kamalak et al., 2005; Martínez et al.,
2008; Sharifi et
al., 2019). La producción de tales
muestras es costosa por lo que la colaboración entre laboratorios es esencial (Rymer et al.,
2005).
Experimentos realizados por Mauricio et al. (1998; 2001), con el fin de
comparar líquido ruminal y heces extraidas como
fuente de inóculo, mostraron que con la materia fecal se aprecian mayores fases
lag y una menor capacidad de fermentación. En trabajos posteriores (Martínez et al.,
2005 y 2008; Sharifi
et al., 2019) llegaron a igual
resultado, los primeros autores con el uso de heces depuestas, lo que agrega la
ventaja de prácticamente no tocar al animal.
El uso de un inóculo más concentrado o de
mayor cantidad de inóculo fecal y el mejoramiento de la actividad fermentativa
de los microrganismos ha sido también investigado (Cubillas, 2010; Cantet et al.,
2020). Estos últimos autores encontraron que un pretratamiento del inóculo en
aras de aumentar su fuerza no era una solución viable.
Otros
inóculos
Cultivos de microorganismos apropiados
podrían, en teoría, ser usados para producir inóculos estandarizados sin el uso
de animales experimentales. Tales cultivos podrían ser preparados con un amplio
rango de actividad que se pueden crear las condiciones para mantenerlos como
tal. Rymer et
al. (2000) investigaron el uso de cultivos bacteriales
con la mezcla de varios microorganismos y compararon los patrones producción de
gas de varios alimentos. Encontraron que, aunque hay diferencias en la forma de
los perfiles con los cultivos bacterianos en que se produce gas a velocidades
mucho más bajas que con los inóculos de líquido ruminal, hubo una alta
correlación entre los parámetros. Aún queda por avanzar en este sentido
Elías et
al. (2005) reportan una metodología para la determinación exitosa de la
digestibilidad de la materia seca y materia orgánica in vitro mediante la utilización de "células lavadas"
(bacterias extraídas de líquido ruminal con la ayuda de la centrifugación).
Esta alternativa puede ser probada para producción de gas in vitro. Basados en ese criterio, Cubillos et al. (2010) propusieron medir la fuerza del inóculo de heces
bovinas depuestas y usar una cantidad inversamente proporcional a dicha fuerza.
Además se han usado heces de equinos (Elghandour et al., 2016; Franzan et al., 2018) y caprinos (Martínez,
2014).
Alcances
de la técnica
La tabla que se muestra a continuación
ofrece una medida de la versatilidad de la técnica de gas in vitro:
|
Tema
|
Autor (es)
|
|
Relación con heces -LR
|
Martinez et al.
(2005); Posada et al. (2012); Pandian et al. (2016); Sáenz et
al. (2022).
|
|
Energía metabolizable
|
Leon (2012); Muizzu y Rizca (2021); Sáenz
et al. (2023).
|
|
Ordenamiento de forrajes
|
Martinez et al.
(2009).
|
|
Efecto de polifenoles uso PEG
|
Martínez (2008); Putri et al. (2021).
|
|
Predecir consumo
|
Rodríguez (2017).
|
|
Evaluación de ensilajes
|
Ligoski (2020).
|
|
Producción de metano
|
Pal et al. (2015); Molho-Ortiz
et al. (2019); Ligoski
(2020); Sucu (2020); Ellis et al. (2020); Kusuma (2022); Wangui et al. (2022).
|
|
Uso de probióticos,
|
Besharati et al. (2009); Elghandour et al. (2016); Sucu
(2020).
|
|
Uso de prebióticos (mananooligosacáridos)
|
Zheng et al. (2019).
|
|
Heno de materiales alternativos
|
Sari et al. (2021)
|
|
Empleo de fito químicos
|
Molho-Ortiz et al.
(2019).
|
|
Empleo de enzimas fibro, amilo y
proteolíticas
|
Freiria et al. (2018).
|
|
Uso de concentrados
|
Ayasan et al.
(2018); Amanzougarene y Fondevila (2020).
|
|
Uso de bloques multinutricionales
|
Herrera-Torres et al. (2022).
|
Como puede apreciarse, en los últimos
años ha predominado el uso de la técnica para la búsqueda de vías que permitan
el control del metano como principal gas de efecto de invernadero producido por
los rumiantes.
Llama la atención que el estudio de la
relación entre líquido ruminal y heces se ha estado estudiando prácticamente
desde que surgió la técnica y aún continúa haciéndose.
CONCLUSIONES
La técnica in vitro de producción de gases es
probablemente la herramienta más versátil de medición de la digestibilidad;
presenta procedimientos didácticos y accesibles; acarrea menos costos; además
representa una alternativa más compatible para las legislaciones de bienestar
animal, al usar las heces como inóculo. Se ha aplicado con
éxito para diversos propósitos en la evaluación de alimentos para rumiantes,
incluido el cálculo de la digestibilidad de la materia orgánica, la energía
metabolizable de los alimentos y la cinética de su fermentación; determinar
cómo el valor del alimento se ve afectado por los factores antinutritivos y los
aditivos, etc.
Esta técnica puede medir el volumen de
gas a presión atmosférica constante, la presión de gas a un volumen fijo, o una
combinación de ambos procedimientos, empleando metodologías manuales,
semiautomáticas y automáticas.
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Contribución
de los autores
Concepción
y diseño de la investigación: SM, EE, DP, RP; análisis e interpretación
de los datos: SM, EE, DP, ML; redacción del artículo: SM, EE, DP, RP.
Conflicto
de intereses
Los autores declaran que no existen
conflicto de intereses.
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, Enrique
Espinosa Sifontes *